基于CRISPR系統開發出的引導編輯系統（Prime Editing，PE）能夠在基因組的靶位點處實現精準的片段插入、刪除以及堿基的任意替換，在基因治療、育種改良、基礎研究等方面頗具應用前景。中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組前期在水稻、小麥中建立并優化了植物引導編輯系統，實現了任意堿基精準的替換、增添或刪除。然而，在應用過程中，研究組發現該系統存在效率偏低、設計復雜等問題，難以滿足育種需要以及在不同基礎研究場景下的需求（Lin et al., Nature Biotechnology, 2020）。對此，研究組通過對PE系統進行多輪升級改造，開發出“Tm值指導PBS序列設計”“雙pegRNA策略”“逆轉錄酶的工程化改造”三種優化策略，將引導編輯系統效率平均提升了10倍以上，并開發了在線的高效、自動化引導編輯實驗設計網站PlantPegDesigner（Lin et al., Nature Biotechnology, 2021；Zong et al., Nature Biotechnology, 2022）。
　　為了進一步推進引導編輯的應用，高彩霞研究組在Nature Protocols上發表論文，闡釋了如何克服引導編輯設計復雜的問題。該工作描述了高效pegRNA的設計方法：前期研究發現植物細胞中pegRNA的編輯效率與PBS序列的Tm值（melting temperature，Tm）有關，在水稻中PBS序列Tm值為30℃的pegRNA能夠獲得最大的編輯效率；使用雙pegRNA策略，即針對所需突變同時向細胞中遞送分別靶向DNA兩條鏈的兩個pegRNA進行共同編輯，可進一步大幅提升植物引導編輯的編輯效率?？蒲腥藛T論述了在線自動化pegRNA設計網站PlantPegDesigner的使用流程。該網站可兼顧上述兩種策略，提供完整的pegRNA選擇、設計與推薦方案，方便使用者快速設計高活性pegRNA。進一步，該研究闡明如何使用能夠穩定提高編輯效率的ePPE引導編輯器。相比于傳統版本的引導編輯器，ePPE在堿基替換、小片段插入、刪除以及較大片段的插入和刪除等多種編輯類型下的編輯效率顯著提升，且不增加副產物及脫靶效應。該論文闡述了載體組合的使用、基于原生質體的編輯效率檢測、引導編輯系統的植物細胞熒光報告系統的使用以及引導編輯實驗結果的二代測序數據分析等流程。該文章提出的實驗方法，可在2~3周內完成引導編輯的原生質體實驗，最快在3個月內獲得經過引導編輯的再生水稻植株。此外，該方法可以便捷地推廣到其他物種中，并隨著新型引導編輯工具的不斷優化而得到更廣泛的應用。
　　三位審稿人均對該文章給予高度評價：“作者全面、系統地介紹了如何在作物中實現高效的基因組編輯，以流暢、易讀的方式總結了引導編輯的實驗方法”“該論文邏輯清晰，對試圖在水稻或其他植物物種中進行引導編輯的研究人員非常有用”“這是一篇想對水稻、小麥或玉米進行引導編輯的科研人員的非常好的實驗指南”。
　　11月25日，相關研究成果在線發表在Nature Protocols（DOI：10.1038/s41596-022-00773-9）上。研究工作得到農業農村部、中科院戰略性先導科技專項（A類）、中國科學技術協會青年人才托舉工程、博士后創新人才支持計劃等的支持。
　　高效植物引導編輯實驗流程。（a）高效、自動化的pegRNA 設計方法；（b）引導編輯實驗設計與植物突變體獲得。